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      BD C6流式細胞儀標本的制備步驟及注意事項

      更新時間:2017-06-19瀏覽:4090次
       一、 BD C6流式細胞儀標本的制備具體步驟:
       
      1、收集細胞。上皮細胞需要蛋白酶消化,然后收集。加PBS或者流式洗液1ml,振蕩,1400rpm離心5min,棄上清。
       
      2、染表型懸浮細胞于100ul體積,細胞濃度約為或者小于1X10^6,加入流式染色抗體。按照說明書用量或者減半(根據經驗),分出一管作為同型。
       
      3、4℃,避光30min,用PBS洗一遍,1400rpm離心5min,棄上清。
       
      4、破膜破膜劑以BDpharmingen破膜劑為例,加300ul,4℃,避光30min以現配的破膜洗液1ml洗一遍。1400rpm離心5min,棄上清。
       
      5、胞內染色加入流式抗體4℃,避光30min。用破膜洗液1ml洗一遍,1400rpm離心5min,棄上清。
       
      6、加入200ul1~2%多聚甲醛4℃避光保存。一般情況下,可直接把抗體加入到棄上清后的殘留液里(體積大概為50ul左右)。
       
      二、 BD C6流式細胞儀標本制備注意事項:
       
      1、整個操作在4℃下進行,洗滌液中加有比常規防腐劑量高10倍的NaNO3,上述實驗條件是防止一抗結合細胞膜抗原后發生交聯、脫落;
       
      2、洗滌要充分,以避免游離抗體封閉二抗與細胞膜上一抗相結合,出現假陰性;
       
      3、加適量正常兔血清可封閉某些細胞表面免疫球蛋白Fc受體,降低和防止非特異性染色;
       
      4、細胞活性要好,否則易發生非特異性熒光染色。
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